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Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob a licença Creative Commons Attribution. Que permite o uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o trabalho original seja devidamente citado. Os macrólidos são um grupo de fármacos cuja actividade provém da presença de um anel macrólido, um grande anel lactona macrocíclico ao qual um ou mais açúcares desoxi podem estar ligados. Eles são produzidos por espécies de Streptomyces e usados ​​principalmente contra bactérias gram-positivas. A determinação de antibióticos, incluindo macrólidos, é realizada principalmente por ensaios microbiológicos. No entanto, os ensaios microbiológicos tendem a carecer de especificidade. E, portanto, para superar esse problema, muitos métodos químicos e instrumentais foram desenvolvidos para determinar macrólidos separadamente, bem como simultaneamente. Diferentes métodos cromatográficos, espectrofotométricos e eletroquímicos utilizados para a determinação de macrólidos foram revisados ​​neste trabalho. Os antibióticos são substâncias produzidas por microrganismos, que suprimem o crescimento ou matam outros microorganismos em concentrações muito baixas 1. Os antibióticos podem ser classificados como antibióticos lactâmicos, amino-glicósidos, antibióticos macrólidos, tetraciclinas, antibióticos polieno, derivados de nitro-furano, e assim por diante com base na sua estrutura química. Os macrólidos são um grupo de fármacos que pertencem à classe de policetídeos de produtos naturais e cuja actividade decorre da presença de um anel macrólido, um grande anel de lactona macrocíclica ao qual podem ser ligados um ou mais açúcares deoxi, usualmente cladinose ou desosamina. Os anéis de lactona são normalmente 14, 15 ou 16 membros. Os antibióticos de macrólidos, produzidos por espécies de Streptomyces, são utilizados principalmente contra bactérias gram-positivas. A utilização de antibióticos macrólidos envolve uma série de problemas, tais como o aumento da resistência de estirpes gram-positivas e gram negativas, acção bactericida lenta, perturbações gastrointestinais associadas, reacções alérgicas e efeitos hepatotóxicos. Portanto, o número de novos macrólidos de 14, 15 e 16 membros tem aumentado ao longo dos últimos anos 4. Os antibióticos macrólidos mais utilizados consistem num anel lactona macrocíclico contendo 14, 15 ou 16 átomos com açúcares ligados por ligações glicosídicas 5. Todos os macrólidos contêm um anel lactona macrocíclico ao qual está ligado um ou mais açúcares. As suas propriedades farmacodinâmicas são muito semelhantes e, em geral, têm baixa toxicidade e o mesmo espectro de actividade antimicrobiana com resistência cruzada entre membros individuais do grupo. São bacteriostáticos ou bactericidas, dependendo da concentração e do tipo de microrganismo, e interferem com a síntese de proteínas bacterianas. O seu espectro antimicrobiano é semelhante ao das penicilinas, mas também são activos contra Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumonia. E alguns Rickettisias e Chlamydias 6. 1.1. Membros de Antibióticos Macrolídeos Os antibióticos macrólidos clinicamente úteis podem ser convenientemente classificados em três grupos com base no número de átomos no núcleo lactona. 1.1.1. Os antibióticos macrólidos de 14 membros Eritromicina Eritromicina (Figura 1 (I)) foram isolados dos produtos metabólicos de uma estirpe de Streptomyces erythreus por um grupo de cientistas filipinos em 1949, que foi encontrado na amostra de solo. O produto foi lançado comercialmente em 1952 sob a marca de ilosona. Anteriormente, a eritromicina também era iloticina. A eritromicina está disponível em comprimidos com revestimento entérico, cápsulas de libertação lenta, suspensões orais, soluções oftálmicas, pomadas, géis e injecções. Figura 1: Estrutura química de antibióticos macrólidos de 14 membros. (Ix2014Eritromicina, IIx2014Claritromicina, IIIx2014Roxitromicina, IVx2014Diritromicina). Claritromicina Clarithromycin (Figura 1 (II)) foi inventado por cientistas da Japan Taisho Pharmaceutical empresa na década de 1970. O produto emergiu através de esforços para desenvolver uma versão do antibiótico eritromicina que não experimentou instabilidade ácida no trato digestivo e, assim, causar efeitos colaterais, como náuseas e dores de estômago. Taisho pediu proteção de patente sobre sua nova droga por volta de 1980 e posteriormente introduziu uma versão de marca de sua droga, chamada clarith, para o mercado japonês em 1991. A claritromicina é comumente administrada em comprimidos e comprimidos de liberação prolongada, suspensão oral ou em um Gel / loção para uso tópico. Roxitromicina A roxitromicina (Figura 1 (III)) é um antibiótico macrólido semisintético, e foi trazida pela empresa farmacêutica alemã Hoechst Uclaf em 1987. É utilizada para tratar infecções do tracto respiratório, urinárias e tecidos moles. A roxitromicina é derivada da eritromicina, contendo o mesmo anel lactona de 14 membros. Contudo, uma cadeia lateral N-oxima está ligada ao anel lactona. Também está actualmente a ser submetido a ensaios clínicos para o tratamento da perda de cabelo masculino padrão. Roxitromicina é comumente disponível como comprimidos ou suspensão oral. Diritromicina Diritromicina (Figura 1 (IV)) é um derivado pró-fármaco mais lipossolúvel de 9S-eritromiciclamina, derivado semi-sintético de eritromicina, preparado por condensação deste último com 2- (2-metoxietoxi) acetaldeído. O anel 9N, 11O-oxazina assim formado é instável sob condições aquosas tanto aquosas como alcalinas e sofre hidrólise espontânea para formar eritromiciclina. A eritromiciclamina retém as propriedades antibacterianas da administração oral de eritromicina. O pró-fármaco, a diritromicina, é fornecido como comprimidos com revestimento entérico para o proteger da hidrólise catalisada por ácido no estômago. A administração oral de diritromicina é rapidamente absorvida pelo plasma, em grande parte pelo intestino delgado. A hidrólise espontânea da eritromiciclamina ocorre no plasma. 1.1.2. A Azitromicina Azitromicina (Figura 2) é uma subclasse de antibióticos macrólidos, que havia sido descoberta por uma equipe da companhia farmacêutica croata, pesquisadores Pliva em 1980. A azitromicina é um dos antibióticos mais vendidos no mundo e é derivado de Eritromicina contudo, difere quimicamente da eritromicina pelo facto de se incorporar um átomo de azoto substituído com metilo no anel de lactona, tornando assim o anel de lactona de 15 membros. A azitromicina é comummente administrada em comprimidos ou em formas de suspensão oral. Também está disponível para injecção intravenosa. Figura 2: Estrutura química da azitromicina. 1.1.3. Os antibióticos macrólidos de 16 membros Estes são tipos de antibióticos macrólidos, que contêm 16 átomos no núcleo lactona (Figura 3). Estes são Carbomycin A, Josamicina, Kitasamycin, Midecamicina acetato, Spiramycin, Troleandomycin, e Tylosin. No entanto, estes antibióticos não são comumente usados ​​como o dos grupos de 14 e 15 membros. A maioria deles também tem usos veterinários. Figura 3: Estrutura química de antibióticos macrólidos de 16 membros. (Ix2014Spiramycin, IIx2014Tilosina, IIIx2014Midecamicina). 1.2. Farmacologia de Macrólidos Antibióticos Mecanismo de Acção Todos os macrólidos têm um mecanismo de acção semelhante, que é a inibição da biossíntese da proteína bacteriana pela ligação irreversível à subunidade 50-S do ribossoma bacteriano, inibindo assim a translocação do peptidilo t-ARN. Esta ação é principalmente bacteriostática, mas também pode ser bactericida em altas concentrações. Os macrólidos tendem a acumular-se nos leucócitos e, por conseguinte, são efectivamente transportados para o local da infecção 7. Aplicações Terapêuticas Os macrólidos são utilizados para tratar infecções como infecções do tracto respiratório e dos tecidos moles. O espectro antimicrobiano dos macrólidos é ligeiramente mais largo do que o das penicilinas, pelo que os macrólidos são um substituto comum para os doentes com alergia à penicilina. Ao contrário da penicilina, os macrólidos demonstraram ser eficazes contra micoplasmas, micobactérias. Alguns rickettsia. E clamídia 8. Clarithromycin também é usado para tratar úlceras gástricas devido a H. pylori como um componente de combinação multidrogas [9]. Efeitos adversos Anorexia, náuseas, vômitos e diarréia ocasionalmente acompanham a administração oral. A intolerância gastrointestinal, que é estimulação direta da motilidade intestinal, é a razão mais freqüente para descontinuar esses antibióticos. A eritromicina, particularmente o estolato, pode produzir hepatite colestática aguda (febre, icterícia, função hepática comprometida), provavelmente como uma reação hipertensiva 10. A administração intravenosa resulta frequentemente em tromboflebite, particularmente se for utilizada uma dose elevada. Reações alérgicas, particularmente erupções cutâneas, raramente ocorrem 11. Outras atividades de Macrolide Antibióticos Macrolide antibióticos têm uma variedade de ações além de atividades antimicrobianas. Recentemente, tem sido sugerido que os antibióticos macrólidos actuam como imunomoduladores. Os efeitos de antibióticos macrólidos excepto a azitromicina na estimulação de funções de macrófagos têm sido descritos 12. Vários pequenos ensaios clínicos mostraram que eritromicina, claritromicina e azitromicina possuem características anti-inflamatórias em pacientes com doenças respiratórias. Para determinar se os antibióticos macrólidos possuem esta característica única, os dados de ensaios controlados envolvendo seres humanos foram extraídos e analisados. Conclusões dos ensaios sugerem que os antibióticos macrólidos selecionados possuem propriedades anti-inflamatórias em pacientes com doenças respiratórias que não apresentam evidências de infecção bacteriana 13. 1.3. Farmacocinética de antibióticos de macrólidos A eritromicina é facilmente inactivada por diarreia, pelo que todas as formulações administradas por via oral são dadas como laxantes ou ésteres com revestimento entérico ou mais estáveis, tais como etilsuccinato de eritromicina. Eritromicina é muito rapidamente absorvido e difunde na maioria dos tecidos e fagócitos. É metabolizado pela desmetilação no fígado. Sua principal via de eliminação está na bile, e uma pequena porção na urina. A meia-vida de eliminação de Erythromycinx2019s é de 2,5 horas. Ao contrário da eritromicina, a azitromicina é ácida estável e pode portanto ser tomada por via oral sem necessidade de protecção contra ácidos gástricos. É facilmente absorvido e difundido na maioria dos tecidos e fagócitos. A concentração de azitromicina nos tecidos pode ser 50 vezes superior à do plasma. Isto é devido à captura de íons ea alta solubilidade lipídica. Após uma única dose de 500x2009 mg, as concentrações plasmáticas de azitromicina diminuíram num padrão polifásico com uma depuração plasmática média aparente de 630x2009mL / min e uma semi-vida de eliminação terminal de 68 horas. Acredita-se que a meia-vida terminal prolongada seja devida a extensa captação e subsequente libertação de fármaco a partir de tecidos. A excreção biliar de azitromicina, predominantemente inalterada, é uma importante via de eliminação. Ao longo de uma semana, aproximadamente 6x25 da dose administrada aparece como fármaco inalterado na urina. Quando tomado antes de uma refeição, a roxitromicina é muito rapidamente absorvida e difundida na maioria dos tecidos e fagócitos. Apenas uma pequena porção de roxitromicina é metabolizada. A maior parte da roxitromicina é secretada inalterada na bílis e alguns em ar expirado. Menos de 10x25 é excretado na urina. Roxithromycinx2019s meia-vida é de 12 horas. 1.4. Propriedades fisicoquímicas dos macrólidos Os antibióticos macrólidos são estruturalmente caracterizados por quatro porções comuns: a presença de um anel de lactona grande, um grupo cetona, um amino-açúcar ligado glucosicamente ligado ao aminoácido ou ao núcleo e uma porção dimetilamino no resíduo de açúcar, o que torna Os antibióticos básicos 14. Os valores de PKa da maioria dos macrólidos variaram entre 6,0 e 9,0 e proporcionam a possibilidade de preparar os seus sais clinicamente úteis 15. São geralmente não polares e quase insolúveis em água. Eritromicina ocorre como branco ou ligeiramente amarelo, inodoro ou quase inodoro, ligeiramente higroscópico, cristais ou pó. Ao contrário da azitromicina, a eritromicina tem um ponto de fusão mais elevado, 135x2013140xb0C. É opticamente activo com 2 5 D de x221278xb0 a uma concentração de 0,0199x2009mgx2009mL x22121 em metanol. Apresenta máximos de absorção de UV característicos quando dissolvidos em água (pH 6,3) a 280x2009nm (50). O valor de pKa é superior à azitromicina (8,8), mas o perfil de solubilidade é semelhante ao da azitromicina 16. A azitromicina tem um ponto de fusão de 113x2013115xb0C. É levorotatory com 2 5 D de x221237xb0 na concentração de 0.01x2009mgx2009mL x22121 em chloroform. Não tem nenhum máximo de absorção de UV característico em qualquer solvente. Tem um valor de pKa de 7,9. A solubilidade da azitromicina em água é 2x2009mgx2009L x22121. É, no entanto, livremente solúvel em álcoois, acetona, clorofórmio, acetonitrilo e acetato de etilo e moderadamente solúvel em éter, cloreto de etileno e acetato de amilo. A claritromicina exibe um ponto de fusão mais elevado, 217x2013220xb0C, e é levógira com 2 5 D de x221290.4xb0 a uma concentração de 1x2009 mg / mL em clorofórmio. O seu espectro de UV em clorofórmio exibe máximos de absorvância a 288x2009nm (27,9) e o perfil de solubilidade é como a azitromicina 17. A tilosina é um pó cristalino quase branco ou ligeiramente amarelo, com ponto de fusão 128x2013132xb0C. Também é solúvel em água (5x2009mgx2009mL x22121 a 25xb0C). No entanto, é menos solúvel em álcoois, ésteres, cetonas, benzeno, éter e clorofórmio. Tem um valor de pKa de 7,73 e máximos de absorção de UV a 282x2009nm com coeficiente de extinção (E1cm, 1x25) 245. 2. Técnicas analíticas para a determinação de antibióticos de macrólidos A determinação de antibióticos, incluindo macrólidos, é realizada principalmente por ensaios microbiológicos. No entanto, os ensaios tendem a carecer de especificidade. E, portanto, para superar este problema, muitos métodos químicos e instrumentais foram desenvolvidos em diferentes tempos por diferentes pesquisadores para determinar estes macrólidos separadamente, bem como simultaneamente. Estes métodos que foram desenvolvidos para analisar macrólidos incluem métodos cromatográficos, métodos espectrofotométricos e métodos electroquímicos. 2.1. Técnicas Cromatográficas 2.1.1. Cromatografia em Camada Fina e Cromatografia em Papel A cromatografia em camada fina é uma das técnicas mais importantes para a análise qualitativa e semiquantitativa de drogas em pós volumosos, formas de dosagem e fluidos corporais. Os métodos de detecção de drogas TLC são simples, baratos, seletivos e semicuantitativos, e podem ser usados ​​em laboratório ou no campo em locais como um porto de entrada, centro de distribuição, clínica, farmácia ou hospital. A TLC pode indicar se o ingrediente activo está presente e o seu teor de conteúdo e, por conseguinte, o produto é qualificado ou autorizado nesta base. Algumas substâncias relacionadas podem também ser detectadas e quantificadas. Contudo, a TLC não detectará falsificações que tenham ingredientes activos ou inactivos errados se não forem visualizados pelo método de detecção utilizado para o fármaco activo correcto 18. As tentativas iniciais para analisar a eritromicina envolveram o uso de TLC para separar eritromicina A e eritromicina B, éter enólico de pseudoeritromicina A e anidroeritromicina. A separação foi efectuada em placas de TLC de gel de sílica utilizando várias misturas de solventes orgânicos e os compostos relevantes visualizados por pulverização com ácido sulfúrico aquoso 50x25 e carbonização. Também se utilizou pulverização de visualização constituída por sulfato de cério (1x25) e ácido molibdico (2,5x25) em ácido sulfúrico 10x25 19. A TLC sobre gel de sílica seguida por densitometria foi aplicada à base de eritromicina separada e estolato de eritromicina em cápsulas 20. A separação de eritromicina de comprimidos de estearato de eritromicina e suspensões de estolato de eritromicina por CCF em gel de sílica foi relatada em 1976 21. Kibwage et ai. 22 separaram eritromicina A, eritromicina B, eritromicina C e eritromicina D utilizando TLC revestida com Kieselgel GF254 e pulverizaram com uma mistura de anisaldeído-ácido sulfúrico-etanol (1x2009: x20091x2009: x20099) e aqueceu-se. Também foi relatado um método de TLC para a separação de eritromicina, tilosina, oleandomicina e espiramicina em produtos pecuários 23. As placas foram pulverizadas com xantidrol e aquecidas a 110xb0C durante 5x2009 min. A análise semiquantitativa foi realizada por varredura de densitometria a 525x2009nm. A fluritromicina é um novo antibiótico macrólido utilizado como sal etilsuccinato. Colombo et ai. 24 relataram sistemas de TLC para a identificação cromatográfica, quantificação e subsequente identificação estrutural de etilsuccinato de fluritromicina. A separação por TLC foi efectuada e as manchas foram visualizadas por exposição a vapor de iodo ou por pulverização com uma mistura de ácido anisaldeído-ácido sulfúrico-ácido acético glacial-metanol e aquecimento. Lees et ai. 25 descreveram a utilização de uma análise cromatográfica em papel para a separação das oleandomicinas acetiladas em misturas antibióticas multicomponentes. Verificou-se que os sistemas de solventes altamente polares eram adequados para a separação da base de oleandomicina e dos seus derivados acetilados, incluindo a triacetil-oleandomicina. In addition, the effects of pH of the paper and of the solvent system on the chromatographic separation of magnamycin, erythromycin stearate, oleandomycin phosphate, picromycin, and methymycin were investigated. Different researches have shown that the use of buffered solvents completely eliminated the tailing of spots and so that the evaluation of the spot would very precise and accurate. The use of High Performance Thin Layer Chromatography in the analysis of some sixteen-membered ring macrolide antibiotics like Spiramycins, Tylosins, Turimycins, and 9-Propionyl maridomycins was examined by Bens et al. (1980). In the case of Spiramycins, instrumentalized HPTLC proved to be very efficient for the separation and determination of these antibiotics. With the use of an internal standard together with the data pair technique in sampling and evaluation of the HPTLC plates, a coefficient of variation less than 1.5x25 could be achieved when determining the different Spiramycins. Other sixteen-membered macrolides, such as Tylosins, Turimycins, and 9-Propionylmaridomycins can be separated with sufficient resolution for quantitative work, in spite of their extremely similar structures and large molecular weights. Detection is always at wavelengths, which agree with the intrinsic absorption maximum of the chromophors of the components (e. g. 282x2009nm for Tylosins, 232x2009nm for Spiramycins and Turimycins, and 195x2009nm for 9-Propionylmaridomycins) 26 . 2.1.2. Gas Chromatography Gas-liquid chromatography has been used for the quantitative analysis and separation of erythromycin in mixtures containing erythromycin A, erythromycin B, erythromycin C, erythrolosamine, and propionyl erythromycin using flame-ionization detection. Similarly, erythromycin A and erythromycin B were separated and quantitated in the presence of erythromycin C and erythrolosamine in erythromycin tablets 27 . A procedure for the qualitative identification of erythromycin in erythromycin ethyl succinate capsules using pyrolysis-gas chromatography has also been reported 28 . 2.1.3. High-Performance Liquid Chromatography An early report describing the application of liquid chromatography for the analysis of erythromycin A, erythromycin B, and leucomycins was published in 1973 29 . Erythromycin has a low molar absorptivity as it lacks a suitable chromophore. Thus, specific, selective, and sensitive UV detection of this compound is difficult. To overcome this problem, low UV wavelength, where considerable UV absorption occurs, has been used. This generally necessitates the use of extensive precolumn extraction procedures in order to eliminate potentially interfering components, particularly when using complex matrices such as biological fluids and tissues. Generally, a wavelength of 215x2009nm has proved to be the most useful wavelength to monitor erythromycin and related compounds and has been extensively used in most applications. An HPLC method for the simultaneous determination of five macrolides (josamycin, kitasamycin, mirosamicin, spiramycin, and tylosin) in meat has been reported. The drugs were extracted with 0.3x25 metaphosphoric acid-methanol (7x2009:x20093, v/v), and the extracts were cleaned up on a Bond Elut SCX cartridge. The HPLC separation was performed on octadecyl analytical column with a gradient system of 0.025x2009M phosphate buffer (pH 2.5) and acetonitrile as the mobile phase. The drugs were detected at 232x2009nm for josamycin, kitasamycin, mirosamicin, and spiramycin, and 287x2009nm for tylosin 30 . HPLC with ultraviolet detection has been used for the analysis of azithromycin in bulk samples, for the separation of related compounds produced during synthesis, and for acid degradation studies. Methods for the HPLC analysis of azithromycin in biological samples have also been described using various methods of detection in order to overcome the limitations of poor UV absorbance. Shepard et al. 31 used both coulometric and amperometric methods for the detection of azithromycin in human and animal tissues and serum. Like erythromycin, clarithromycin has no conjugated double bond in the lactone ring hence significant UV absorbance is only obtained at wavelengths below 210x2009nm. Whilst UV detection of clarithromycin may be suitable for most in vitro samples, electrochemical detection has proved to be most effective when quantitation of low concentrations of the drug in biological samples is required. Morgan et al. 32 , using reversed-phase chromatography at 50xb0C with UV detection, were able to separate clarithromycin and eight related compounds produced during the synthetic process. They found that separation was largely dependent on the organic-aqueous ratio of the mobile phase and, in contrast to erythromycin, almost unaffected by temperature and pH, although an elevated column temperature was used to maintain peak symmetry and resolution. Torano and Guchelaar (1998) have reported an HPLC method for the determination of erythromycin, azithromycin, clarithromycin, and roxithromycin in human serum. A diethyl ether extract, obtained from serum using a saturated sodium carbonate solution, was treated with 9-fluorenylmethyl-oxycarbonyl chloride for 40x2009min at 40xb0C and chromatographed on a base-deactivated octadecyl column, maintained at 50xb0C during elution, using an eluent composed of acetonitrile-hydrogenphosphate buffer, pH 7.5, with 0.125x25 triethylamine (3x2009:x20092, v/v). Fluorescence detection was used at an excitation wavelength of 255x2009nm and an emission wavelength of 315x2009nm 33 . An HPLC method with fluorescence detection for the determination of roxithromycin in human plasma was described by Owka and Karazniewicz-lada (2007). After solid-phase extraction, roxithromycin and erythromycin (as internal standard) were derivatized by treatment with 9-fluorenylmethyl chloroformate. Optimal resolution of fluorescence derivatives of roxithromycin and the internal standard was obtained using reversed phase, C18 column. The mobile phase was composed of potassium dihydrogenphosphate solution, pH 7.5, and acetonitrile. Fluorescence of the compounds was measured at the maximum excitation, 255x2009nm and emission, 313x2009nm, of roxithromycin derivatives. The method has been validated and would be successfully applied for pharmacokinetic studies of roxithromycin after administration of a single tablet of roxithromycin 34 . In 2000, Gandhi et al. 35 described an HPLC method using amperometric detection for the analysis of azithromycin that is, for assay and dissolution test in different dosage forms. Patricia Zubata et al. (2002) have utilized HPLC techniques for the determination of azithromycin in bulky powder and different dosage forms. The authors have described that the use of reversed phase chromatographic conditions at 215x2009nm detection is the most optimized method and gave accurate and precise results 36 . Macrolide antibiotics, which have veterinary application like spiramycin, tilmicosin, and tylosin, can be determined from food of animal origin, like meat, liver, kidneys, raw milk, and eggs by HPLC method. The method is based on a solid phase extraction clean-up with a cation exchange cartridge and a separation by liquid chromatography with UV detection. The author has described that the selectivity of the method is very good, and no interfering peaks are observed for various food matrices 37 . Chen et al. (2006) have described the application of liquid chromatography with mass spectrometric detection. As the authors have revealed, azithromycin was extracted from plasma with methyl tert - butyl ether-hexane (50x2009:x200950, v/v). The organic phase was evaporated to dryness at 40xb0C and dissolved in mobile phase. The separation was carried out on a reversed-phase octadecyl analytical column with a mobile phase containing of 20x2009mM ammonium acetate-(pH 5.2) acetonitrile-methanol (50x2009:x200940x2009:x200910, v/v/v) at a flow rate of 0.2x2009mL/min. Azithromycin and its internal standard, clarithromycin, were measured by electro-spray ion source in positive selective ion monitoring mode. The limit of quantification for azithromycin in plasma was 2x2009ngx2009mL x22121 with good accuracy and precision. The authors have applied the established method to bioequivalence study of azithromycin in two formulations 38 . Another electrospray high-performance liquid chromatographic tandem mass spectrometric (HPLC-MS-MS) method capable of determining the following five macrolides: tylosin, tilmicosin, spiramycin, josamycin, erythromycin in several tissues (muscle, kidney, liver), eggs, and milk has been presented by Dubois et al. (2001). In this method, roxithromycin was used as an internal standard. The method uses extraction in a Tris buffer at pH 10.5, followed by protein precipitation with sodium tungstate and clean-up on a solid-phase extraction column. The HPLC separation was performed on an octadecyl analytical column protected by a guard column, with a gradient of aqueous 0.1x2009M ammonium acetate-acetonitrile as the mobile phase 39 . USP and BP are also mentioned in this technique to be used for the analysis of certain types of macrolide antibiotics. For example, the analysis of erythromycin tablet and erythromycin lactobionate intravenous injections by using HPLC has been stated in BP. Similarly, clarithromycin (raw material, oral suspension, and tablet), azithromycin (raw material, capsule, and oral suspension), dirithromycin (raw material, and delayed release tablet), erythromycin raw material and content of tylosins can be analyzed by the use of HPLC as stated in the USP 16. 40 . Different Chromatographic Conditions Stated in Official Monographs and Some Published Literatures for the Analysis of macrolide antibiotics in different formulations and biological matrices are summarized in Tables 1 and 2. respectively. Table 1: Summary of chromatographic conditions for the analysis of some macrolide antibiotics from bulk powder and different formulations in official monographs and literatures. Summary of chromatographic conditions for the analysis of some macrolide antibiotics from bulk powder and different formulations in official monographs and literatures. Table 2: Biological matrices multianalyte methods. Biological matrices multianalyte methods 2.1.4. Capillary Electrophoresis The advent of capillary electrophoresis and its application for the separation and quantitative analysis of drugs and mixtures thereof will undoubtedly make a significant impact as yet another important analytical procedure. Although capillary electrophoresis has already been successfully applied to analyze many drugs, only a few publications to-date have been reported using this technique for the separation and quantitation of erythromycin. The method of Flurer 50 described methods to study various mixtures of macrolide antibiotics. Selected macrolides were analyzed by capillary electrophoresis in two separation schemes. Both systems separated oleandomycin from its triacetate derivative, troleandomycin, and erythromycin from some of its derivatives. Lalloo and Kanfer have described the development of capillary elecrophoresis method for the separation of erythromycin, josamycin, and oleandomycin, and a subsequent paper by the same authors describes the same technique for the quantitative determination of erythromycin and related substances 51 . Capillary electrophoresis was utilized in the analysis of macrolide antibiotics like clarithromycin, erythromycin, oleandomycin, troleandomycin, and spiramycin. In order to assist in analyte solubilization, two buffer systems using acetonitrile were developed. The first system involved 30x2009mM sodium cholate and 20x25 acetonitrile in 80x2009mM sodium phosphate, pH 6. This buffer permitted the baseline resolution of all five glycoconjugated antibiotics. In addition, erythromycin was separated from its derivatives estolate and ethylsuccinate. In the absence of surfactants, a higher acetonitrile quantity, 65x25, was used in the second buffer system, with 35x2009mM sodium phosphate, pH 6. Selectivity between oleandomycin and clarithromycin was reversed in this system compared to the cholate buffer, indicating solute interaction with the cholate micelles in the previous system. Calibration linearity and detection sensitivity were improved in the high acetonitrile buffer, due to decreased background absorbance. It was demonstrated that both buffer systems can be utilized for the visualization of minor components that may be present in bulk pharmaceuticals 42 . 2.2. Spectrophotometric Techniques Macrolide antibiotics do not have sufficient chromophoric groups, which enable this group of compound to be determined directly by spectrophotometer. They absorb at shorter wavelengths at which more interference exist. And hence it is necessary to derivative or make complex of these compounds to colored product to be determined spectrophotometrically. Spectrophotometer is an important detector, which is widely used with HPLC and HPTLC for the detection of macrolide antibiotics 2.2.1. Absorption Spectrophotometric Methods Erythromycin has been analyzed by UV-Vis spectrophotometric methods based on reaction with an acidic dye, concentrated sulphuric acid, and ferric ions or on the formation of blue-colored complex with gentian violet at 633x2009nm. Erythromycin, azithromycin dihydrate, clarithromycin, and roxithromycin have been determined in bulk powders, pharmaceutical formulations, and spiked biological fluids by formation of a binary complex between each of these drugs and eosin Y in aqueous-buffered medium. The binary complexes showed absorption maxima at 542x2013544x2009nm. The absorbance of the binary complexes obeyed Beerx2019s law over the concentration range of 1x201310x2009 x3bc gx2009mL x22121 for azithromycin, 2x201320x2009 x3bc gx2009mL x22121 for erythromycin and roxithromycin, and 3x201330x2009 x3bc gx2009mL x22121 for clarithromycin. The limit of detection for erythromycin and azithromycin is 2 xd7 10 x22127. 4 xd7 10 x22127 for clarithromycin, and 3 xd7 10 x22127 molar for roxithromycin 52 . Roxithromycin has been also analyzed by spectrophotometric methods based on either ion-pair formation or on reaction with vanillin and p-dimethylaminobenzaldehyde. Spectrophotometric quantitation of erythromycin, oleandomycin, troleandomycin, spiramycin, and tylosin after reaction with concentrated sulphuric acid is studied at about 470x2009nm by Danielson et al. As the author revealed, the sugar moieties of the antibiotics are the reactive sites for this method and the detection limits are about 0.2x20131.0x2009 x3bc gx2009mL x22121 53 . Azithromycin can be analyzed spectrophotometrically based on the formation of an ion pair between it and an inorganic complex of (Mo(V)-thiocyanate) followed by its extraction with dichloroethane. This ion-association complex shows an orange color and exhibits a maximum absorbance at 469x2009nm. The method obeyed beers-Lambert law in the range of 10 x22126 to 10 x22125 x2009M of Azithromycin. As the author described, the method has been successfully applied to the determination of azithromycin in pharmaceutical formulations without getting any interference from the common excipients present in azithromycin formulations. Furthermore, this spectrophotometric method has been applied successfully to illustrate the dissolution profiles of original tablets and generic compounds hence, it could be employed in routine quality control of azithromycin in pharmaceutical dosage forms 54 . Al-Majed et al. (2004) have presented a spectrophotometric method for the determination of josamycin in its dosage forms and spiked human plasma. The method is based on reaction of the drug with 3-methylbenzothiazolin-2-one hydrazone/ferric chloride system for a fixed time of 20 minutes at 70xb0C and measuring the intensity of the produced color at 665x2009nm. The absorbance-concentration plot is linear over the range of 5.0x201330.0x2009 x3bc gx2009mL x22121 with detection limit of 1.0x2009 x3bc gx2009mL x22121 55 . 2.2.2. Spectrofluorimetric Methods Erythromycin can be determined by spectrofluorimetric methods using erythrosine B, or napthotriazole disulfonate as a derivatizing reagent. The macrolides (erythromycin, erythromycin esters, azithromycin dihydrate, clarithromycin, and roxithromycin) can be analyzed by a simple spectrofluorimetric method based on the oxidation of these drugs by cerium (VI) in the presence of sulphuric acid and monitoring the fluorescence of cerium (III) formed at e x 255x2009nm and e m 348x2009nm. Linear calibration graphs were obtained in the range of 42.6x20131200x2009ngx2009mL x22121. The method was applied successfully for the assay of the studied drugs in pure and pharmaceutical dosage forms as tablets, capsules, and suspension without being affected by the potential interference of excipients like glucose, sucrose, lactose, citric acid, and propylene glycol 56 . El-Rabbat et al. have described a simple spectrofluorometric method for the analysis of 4 macrolide antibiotics. The method is based on the condensation of 10x25 (w/v) malonic acid and acetic acid anhydride under the catalytic effect of tertiary amine groups of the studied macrolides. The relative fluorescence intensity of the condensation product was measured at 397/452x2009nm (excitation/emission) for azithromycin dihydrate and at 392/445x2009nm for clarithromycin, erythromycin ethylsuccinate, and roxithromycin. The effects of potential interference due to common excipients, such as starch, lactose, sucrose, glucose, gum acacia, and magnesium stearate, as well as trimethoprim and sulfisoxazole acetyl formulated in primomycin capsules and pediazole oral suspension, respectively, were studied. The linearity ranges were 3x201380x2009ngx2009mL x22121 for all of the cited macrolides. The limit of detection range was 0.74x20131.20x2009ng mL x22121. while the limit of quantitation range was 2.47x20134.02x2009ngx2009mL x22121. The method was applied for the assay of the studied macrolides in pure pharmaceutical formulations and in spiked biological fluids 57 . 2.3. Electrochemical Techniques Electrochemical techniques like amperometric, voltammetric, and coulometric are widely used as detector for sophisticated analytical instruments like high performance liquid chromatography and capillary electrophoresis. Since these techniques are highly sensitive, they can be commonly utilized for the determination of macrolide antibiotics from biological matrices. The oxidative behavior of azithromycin was studied at glassy carbon electrode in different buffer system using cyclic, linear sweep and differential pulse voltammetry. The oxidation process was shown to be irreversible over the entire pH range studied (5x201311) and was diffusion/adsorption controlled. Analytical method with adequate precision and accuracy was developed for the determination of azithromycin in phosphate buffer at pH 7 as supporting electrolyte containing 10x25 methanol and 0.05x2009M ammonium acetate. The peak current varied linearly with azithromycin concentration in the range 1x201315x2009mgx2009mL x22121. The method was successfully applied for assay of the drug in the pharmaceutical dosage forms. Of the different functional groups of azithromycin, the amine group is the most easily oxidizable. Dialkylamines are oxidized forming a radical cation by loss of one electron. The similar voltammetric behaviour of structurally analogous drug, erythromycin, indicates that the mechanism proposed for the anodic oxidation of azithromycin is initiated by one-electron transfer to form the cation radical at nitrogen on the desosamine sugar residue 58 . In cyclic voltammograms, one well-defined anodic peak was observed. The fact that no peak was observed in the reverse scan suggests that the oxidation process is an irreversible one. The peak currents decrease with succeeding potential scans suggesting an adsorbed species formation on the electrode surface. The voltammetric behaviour of josamycin has been studied using direct current, alternating current and differential pulse polarography by Belal et al. 2002. In Britton-Robinson buffers, josamycin developed cathodic waves over the pH range 7x201312. At pH 10, a well-defined cathodic wave with diffusion current constant of 1. 0 6 0. 1 9 ( 5 ) was reported. The wave was characterized as being diffusion-controlled and partially affected by adsorption phenomenon. The current-concentrations plots are linear over the range 10x201360 and 6x201350x2009 x3bc g mL x22121 using direct current mode and differential pulse polarography mode, respectively. The minimum detectability limit was 1.2x2009 x3bc gx2009mL x22121. The method is applied for the determination of josamycin in human urine besides to pharmaceutical dosage forms especially in tablets 59 . 3. Microbiological Assays The potency of an antibiotic is estimated by comparing the inhibition of growth of sensitive microorganisms produced by known concentrations of the antibiotic being examined and a reference substance. The reference substances used in the assays are substances whose activity has been precisely determined with reference to the corresponding International Standard or International Reference Preparation. The analysis of macrolide antibiotics can be carried out by microbial assay according to the official monographs of USP and BP. The British pharmacopoeia has indicated the microbial assay for the analysis of erythromycin ethyl succinate (in oral suspension and tablet) and for erythromycin stearate tablet. Similarly, USP has also indicated the use of microbial assay for erythromycin, Erythromycin estolate, erythromycin ethyl succinate, erythromycin stearate, tylosin, and troleandomycin in different formulations. Microbial assay can be carried out either by diffusion or turbid metric method. According to BP, the type of solvent, microorganisms, and medium which have been used for analysis of some macrolide antibiotics using diffusion, and turbidmetric methods have been summarized in Tables 3 and 4. Table 3: Buffer solutions, solvents, microorganisms, and incubation temperature employed in diffusion types of microbial assay (BP 2009 and USP 2000). Table 4: Buffer solutions, solvents, microorganisms, and incubation temperature employed in turbidimetric types of microbial assay ((BP 2009 and USPx20092000). Turcinov and Pepeljnjak have optimized a microbial diffusion assay method for determination of Azithromycin potency. Measurements ( 3 0 ) done on an 8 8 Latin Square using the group of optimal test microorganisms Bacillus pumilus, Sarcina lutea . and Escherichia coli have confirmed the results of the experiments and their proper selection. According to the authorsx2019 description, the above-mentioned microorganisms have produced accurate and precise results for the determination of azithromycin potency. In order to select the most suitable media for each test microorganism in the azithromycin content assay by microbiological diffusion method, different solid media at different pH were tested. The solid medium, Peptone 6x2009g, Panc. digest of casein 4x2009g, Beef extract 1.5x2009g, Yeast extract 3x2009g, Glucose 1x2009g, Agar 15x2009g and water to 1000x2009mL at pH 7.7x20137.9 was found to be the most suitable one for the majority of test microorganisms 60 . In spite of the great success of HPLC as a valuable tool for the quantitative analysis of macrolide antibiotics, microbiological and nonchromatographic methods are still extensively used. In particular, some official compendia, such as the United States Pharmacopoeia and British pharmacopoeia, retain microbiological assays for the analysis of erythromycin and other macrolide antibiotics. However, HPLC methods have been used for the determination of some newer macrolides, such as clarithromycin, azithromycin, flurithromycin, and dirithromycin. Several HPLC methods with UV-VIS, fluorescence and mass spectrophotometric detection systems have been employed for the determination of macrolide antibiotics from dosage forms and biological matrices. Few Gas chromatography and capillary electrophoresis methods have been also reported. Spectrophotometric and electrochemical techniques have wide application in the analysis of macrolide antibiotics in bulk powders and different dosage forms. In general, several analytical techniques for the analysis of macrolide antibiotics have been presented. However, further efforts to use widely modern chromatographic techniques, including CE and liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of macrolide antibiotics, will undoubtedly continue. The main goals to be addressed in the future include improved selectivity, sensitivity, analytical simplicity, and efficiency. References K. D. Trigathi, Essentials of Medical Pharmacology . Jaypee Brothers Medical Publishers, New Delhi, India, 5th edition, 2003. J. N. Delgado and W. A. Remers, Textbook of Organic Medicinal and Pharmaceutical Chemistry . Lippincott-Raven, Philadelphia, Pa, USA, 10th edition, 1998. V. T. Andriole, in Proceedings of the 7th Mediterranean Congress on Chemotherapy . Barcelona, Spain, 1990. L. E. Bermudez, C. Inderlied, and L. S. 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No entanto, a qualidade, parâmetros físicos e químicos da água mudam drasticamente conforme a natureza da aplicação da água destilada. Tendo em vista a importância e a necessidade de tal variedade de exigência de água destilada em várias aplicações de laboratório em todo o mundo. Weiber introduz uma variedade de plantas de destilação para se adequar a tais aplicações variadas. Nós fabricamos plantas de destilação de água mantendo em vista a exigência de uso de diferentes laboratórios. A nossa gama de instalações de destilação de água incluem, instalações de destilação de montagem na parede para requisitos laboratoriais regulares, padrão de tabela Barnstead tipo destilação plantas para uso pesado. Vidro single dupla e tripla destilação para alta qualidade água destilada requisitos para laboratório e aplicações médicas. Além disso, temos uma planta de destilação de quartzo high-end para exigência analítica avançada para pesquisa ou trabalho de teste. 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